microbiology

اعتبار کشت های سلولی به عنوان یک مدل عملکرد فیزیولوژیکی در شرایط In vivo  ، بارها مورد انتقاد قرار گرفته است. اغلب سلول فنوتیپ صحیح  In vivo را بیان نمی کند چرا که ریز محیط سلول (microenvironment ) تغییر کرده است. تعاملات سلول با سلول و سلول ماتریس کاهش می یابد، زیرا سلول ها فاقد ناهمگونی و معماری سه بعدی موجود در داخل بدن می باشند و بسیاری از محرک هورمونی و تغذیه ای وجود ندارد. این باعث ایجاد یک محیطی است که به نفع تکثیر، مهاجرت و تکثیر سلول های پروجنیتور تخصص نیافته به جای بیان عملکردهای تمایز یافته می باشد. تاثیر محیط بر کشت از طریق چهار راه بیان می گردد: 

1) خصوصیت  بستری که سلول ها در یا روی  آن رشد می کنند-جامد مثل پلاستیک و یا دیگر ماتریس های جامد ، نیمه جامد مثل  ژل هایی مانند کولاژن یا آگار ، مایع  مثل کشت های معلق (suspension).

2) درجه تماس با سلول های دیگر

3) ساختار فیزیکوشیمیایی و فیزیولوژیکی محیط کشت.

4) ساختار فاز گازی

۵) دمای انکوباسیون

تدارک محیطی مناسب شامل چسبندگی بستر، مواد مغذی و هورمون و یا غلظت فاکتور رشد و اینتراکشن سلولی  برای بیان عملکرد های تخصصی ضروری می باشد.

-         چسبندگی سلول

اکثر سلول ها از بافت جامد به صورت تک لایه های چسبنده رشد می کنند (مگر اینکه آنها را ترنسفورم کرده و تبدیل به لنگرگاه مستقل شوند) و پس از جداسازی بافت یا subculture قبل از شروع به تکثیر آنها نیاز به چسبیدن و گسترش در بستر دارند. ابتدا متوجه شدند که سلول ها بر روی شیشه ای که دارای بار خالص منفی جزئی می باشد چسبیده و تکثیر می کنند. سپس نشان دادند که سلول ها به برخی پلاستیک ها مانند  پلی استایرن می چسبند اگر پلاستیک به صورت  مناسب با یک تخلیه کننده یون الکتریکی یا اشعه یونیزان پر انرژی تیمار شده باشد. ما در حال حاضر می دانیم که چسبندگی سلول با واسطه گیرنده های سطح سلولی خاص برای مولکول ها در ماتریس خارج سلولی صورت می گیرد. بنابراین احتمال دارد که تکثیر با ترشح پروتئین های ماتریکس خارج سلولی و پروتئوگلیکانها توسط سلول ها سریعتر صورت گیرد. ماتریس به سوبسترا باردار می چسبد  و سپس سلول ها از طریق گیرنده های خاص به ماتریس اتصال می یابند. شیشه یا پلاستیکی که سلول های قبلی روی انها رشد کرده اند اغلب می تواند یک سطح بهتر برای اتصال فراهم کند و بسترهای تیمارشده با ترکیبات ماتریس مانند فیبرونکتین یا کلاژن یا مشتقات آن مانند ژلاتین به اتصال محکمتر سلول ها و تکثیر کمک خواهد. با سلولهای فیبروبلاست مانند، نیاز اصلی اتصال سوبسترا و تکثیر و مهاجرت سلول ها به صورت جداگانه در تراکم های پایین است. سلولهای اپیتلیال نیز ممکن نیاز به چسبندگی سلول - سلول برای زنده ماندن و رشد مطلوب داشته باشند  در نتیجه آنها تمایل دارند که در تکه های رشد (patches) کنند.

-  مولکول های چسبندگی سلول :

سه دسته عمده از پروتئین های غشا گذرنشان داده شده است که در چسبندگی سلول - سلول و بستر –سلول نقش دارند. مولکول های چسبندگی سلول – سلول، CAMs ( غیر وابسته به Ca2+ ) و cadherins (وابسته به   Ca2+) در درجه اول در اینتراکشن های بین سلول های همولوگ درگیرهستند. اینها پروتئین های خود تعاملی (self-interactive ) هستند که مولکول ها همولوگ در سلول های مخالف با یکدیگر ارتباط برقرار می کنند و شناسایی سلول - سلول مولد نقش سیگنالینگ در رفتار سلول است. اینتراکشن سلول - بستر عمدتا توسط اینتگرین ها میانجی گری می گردد که دارای رسپتورهایی برای مولکول های ماتریکس مانند فیبرونکتین، اینتکتین ،لامینین و کلاژن می باشند که از طریق موتیف های اختصاصی که معمولا شامل سکانس arginine–glycine–aspartic acid (RGD) هستند  به انها متصل می گردند. هر اینتگرین متشکل از یک دومین الفا و یک دومین بتا می باشد. دومین خارج سلولی انها شدیدا پلی مورفیک است بنابراین تنوع قابل توجهی را بین اینتگرین ها ایجاد می کند. هردو اینتگرین ها و کادهرین ها با وینکولین وارد اینتراکشن می شوند که گامی در سیگنالینگ به هسته می باشد.

سومین گروه مولکول های چسبندگی سلول پروتئوگلیکان های غشا گذر هستند که با سایر ترکیبات ماتریکس مانند سایر پروتئوگلیکان ها یا کلاژن وارد اینتراکشن می شود اما نه از طریق موتیف RGD. برخی پروتئوگلیکان های غشاگذر محلول همچنین به عنوان گیرنده های فاکتوررشد با تمایل پایین عمل می کنند و ممکن فاکتور رشد تثبیت کنند، فعال کنند و یا با رسپتوری با تمایل بالا جابه جا کنند یا در دیمریزاسیون ان شرکت کنند. تجزیه بافت و یا کشت تک لایه (monolayer) متصل توسط پروتئاز، برخی ماتریکس های خارج سلولی را هضم می کند و حتی ممکن برخی دومین های خارج سلولی پروتئین های  غشا گذر را تجزیه کند و اجازه می دهد که سلول ها از هم جدا شوند. سلول های اپیتلیال عموما به تجزیه مقاومترند به دلیل اینکه انها تمایل به کمپلکس های اتصالی محکمتری (desmosomes , adherens junctions و tight junctions) برای کنار هم نگه داشتن خود دارند. در حالی که سلول های مزانشیمی، که بیشتر وابسته به اینتراکشن های ماتریس برای اتصال بین سلولی هستند به راحتی جدا می شوند. سلول های اندوتلیال نیز ممکن است اتصالات محکم ((TJ را در محیط کشت ایجاد کنند. به خصوص اگر در محل تلاقی برای مدت طولانی روی یک ماتریکس از قبل شکل گرفته ( preformed matrix) باقی مانده باشند جداسازی انها مشکل خواهد بود. در هر مورد، سلولها باید پروتئینهای ماتریس را قبل از اینکه متصل شوند دوباره سنتز کنند یا باید یک بستر پوشیده شده با ماتریکس فراهم کنند.

- اتصالات بین سلولی

اگر چه برخی از مولکول های چسبندگی سلول به طور منتشر در غشای پلاسمایی  قرار دارند سایرین در داخل اتصالات بین سلولی سازماندهی شده اند. نقش اتصالات متفاوت است برای مثال دسموزم ها و اتصالات چسبندگی (junctions adherens) سلول های اپیتلیال را در کنا ر هم نگه می دارند. tight junctions فضای بین سلول ها را می پوشانند (درز گیری میکنند) برای مثال بین سلول های ترشحی در یک acinus (گروهی از یاخته های ترشحی در غددی مثل غدد بزاقی ....)  یا مجرا یا بین سلول های اپیتلیال در رگهای خونی و gap junction ها که اجازه می دهد یون ها، مواد مغذی، کوچک و مولکول های سیگنالینگ از قبیل آدنوزین منوفسفات حلقوی (cAMP)  بین سلول های در تماس منتقل شوند. اگر چه ممکن دسموزوم ها در سراسر مناطق در تماس با غشا پلاسمایی توزیع شده باشند، انها اغلب در ارتباط با adherens junctions و tightدر انتهای اپیکال اتصالات سلولی جانبی هستند. همانطور که سلول های اپیتلیال در [1]confluent cultures تمایز پیدا می کنند تعداد بیشتری دسموزوم ایجاد می کنند و اگر برخی سازماندهی های مورفولوژیکی رخ دهد می تواند کمپلکس های اتصالی کاملی را تشکیل دهند. این یکی از دلایلی است که چرا سلول های اپیتلیال، اگر برای مدت زمان طولانی در تلاقی باقی بمانند جدا کردن انها سخت خواهد شد. از انجایی که بسیاری از مولکول های اتصالی در این اتصالات وابسته به یون های Ca2+ هستند اغلب یک عامل چلاته کننده مانند EDTA قبل یا در طی جداسازی به تریپسین اضافه می گردد.

-  ماتریکس خارج سلولی

فضاهای بین سلولی در بافت ها  با ماتریکس خارج سلولی  (ECM) پر شده است. و ترکیب  آن با توجه به نوع سلول تعیین می گردد. فیبروسیت ها، کلاژن نوع یک و فیبرونکتین به داخل ماتریکس ترشح می کنند در حالیکه سلول های اپیتلیال لامینین تولید می کنند. جایی که در آن نوع سلول ها مجاور متفاوت هستند برای مثال در مرز درم (فیبروسیت) و اپیدرم (کراتینوسیت های اپیتلیال)، هر دو نوع سلول در ساخت  ECMبرای تولید یک لایه پایه ( basal lamina) شرکت می کنند. پیچیدگی ECM یک جزء مهم در بیان فنوتیپ سلول هایی که  به آن متصل می شوند بنابراین یک تعادل پویایی وجود دارد به این صورت که سلول هایی که به ECM میچسبند ترکیب ان را کنترل می کنند و به نوبه خود ترکیب ECM فنوتیپ سلول را تنظیم میکند. از این رو تکثیر فیبروبلاست مهاجر نیازمند یک ECM متفاوت از یک سلول اپیتلیال یا نورون در حال تمایز است. اغلب لاین های سلولی کشت داده شده مجازند که ECM متعلق به خود را تولید کنند اما کشت اولیه و انتشار برخی از سلول های تخصصی و القای تمایز آنها ممکن است نیاز به ارائه اگزوژن) خارجی)  ECM  داشته باشد. ECM از کلاژن لامینین، فیبرونکتین، هیالورونان، پروتئوگلیکان ها، فاکتورهای محدود کننده رشد یا سیتوکین ها ساخته شده است. این را می توان با مخلوط کردن ترکیبات خالص مانند کلاژن و فیبرونکتین با استفاده از سلول های تولید کننده ECM  و شستن سلول های تولید کننده قبل از اینکه همراه با سلول های مورد مطالعه مجددا رشد کنند و یا با استفاده از یک ماتریس اماده تولید شده توسط Engelberth-Holm-Swarm (EHS) موش سرطانی که به صورت تجاری به عنوان  Matrigel در دسترس است ،آماده کرد. Matrigel اغلب برای تشویق تمایز و مورفوژنز در محیط کشت بکار می رود واغلب تولید شبکه مشبکی با سلول های اپیتلیال یا اندوتلیال می کنند. حداقل دو جزء اینترکشن با بستر شناخته شده است : ۱) چسبندگی:  اجازه اتصال و گسترش که برای تکثیر سلولی ضروری هستند را می دهد. 2) اینتراکشن های اختصاصی : اینتراکشن سلول های اپیتلیال با غشای پایه با سایر ترکیبات ECM  و یا با سلول های بافت مجاور و برای بیان برخی از عملکردهای های تخصصی مورد نیاز می باشند.ماکرومولکول های ماتریکس های طبیعی و ماتریکس تعریف شده از جمله Matrigel ، Natrigel, ،  کلاژن، لامینین ،ویترونکتین (B-D Biosciences, Invitrogen) در حال حاضر برای مطالعات کنترل شده در مورد اینتراکشن ماتریس در دسترس می باشند. استفاده از ترکیبات ECM  می تواند در افزایش بقای سلول، تکثیر یا تمایز  بسیار مفید واقع گردد مگر این که مولکول های نوترکیب استفاده شوند که خطر قابل توجهی در زمینه ایجاد عوامل نابه جا با منشاء حیوانی وجود دارد. فیبرونکتین و لامینین در حال حاضر به صورت تجاری در دسترس هستند.

-  Cytoskeleton :

مولکول های چسبندگی سلولی به  المنت های سایتواسکلتون می چسبند. چسبندگی اینتگرین ها به میکروفیلامنت های اکتین از طریق پروتئین های اتصالی با سیگنالینگ متقابل بین سطح سلول و هسته همراه است. کادهرین ها همچنین می توانند به سایتواسکلتون اکتین در اتصالات چسبندگی (adherens junctions) متصل شوند و موجب تغییراتی در شکل سلول گردند. دسموزوم ها ،  که همچنین کادهرین ها را بکار میگیرند،  به فیلامنت های حدواسط ، در این مورد سیتوکراتین ها ، از طریق یک پلاک داخل سلولی متصل می شوند. اما هنوز مشخص نیست که آیا این ارتباط صرفا یکی از ویژگی های ساختاری است یا علاوه بر ان دارای ظرفیت سیگنالینگ می باشد. فیلامنت های حدواسط  خاص  دودمان های سلولی هستند و می توانند برای مشخص کردن انها استفاده شوند. میکروتوبول ها سومین جز سایتواسکلتون هستند به نظر میرسد که نقش انها عمدتا مرتبط با تحرک سلولی و تردد داخل سلولی میکروارگانل ها مثل میتوکندری و کروماتیدها در تقسیم سلولی می باشد.

-  تحرک سلولی

ثبت گذشت زمان نشان می دهد که سلول های کشت شده قادر به حرکت روی بستر می باشند. متحرک ترین آنها عبارتند از فیبروبلاست در تراکم سلولی کم (هنگامی که سلول ها در تماس نیستند) و کم تحرک ترین انها تک لایه های متراکم اپیتلیال هستند. فیبروبلاست ها به صورت سلول های منفرد با یک حرکت قطبی قابل تشخیص مهاجرت می کنند.  Lamellipodium، بوسیله پلی مریزاسیون اکتین بوجود میاید ، به صورت جهت دار گسترش پیدا کرده و به بستر میچسبد. غشا پلاسمایی در سمت مخالف سلول منقبض می شود که موجب می شود تا سلول دستخوش حرکت جهت دار گردد. اگر سلولی با سلول دیگر برخورد کند قطب معکوس می گردد ومهاجرت در جهت مخالف ادامه پیدا می کند. مهاجرت در خطوط نامنظمی پیشرفت می کند ، که توسط ردیابی با طلای کلوئیدی نشان داده شد ، تا زمانی که تراکم سلول به اتصال می رسد که در نتیجه ان مهاجرت جهت دار متوقف می گردد. توقف حرکت در محل تلاقی ، که همراه با کاهش در اشفتگی غشا پلاسمایی (plasma membrane ruffling) می باشد،  تحت عنوان مهار تماسی (contact inhibition) شناخته می شود و در نهایت منجربه خروج  سلول ازچرخه سلولی میگردد. میوبلاست ها و سلول های اندوتلیال به روش مشابهی مانند فیبروبلاست ها مهاجرت می کنند و ممکن وقتی اتصال پیدا کردند تمایز پیدا کنند که بستگی به microenvironment دارد. سلول های اپیتلیال در صورتی که تغییر شکل نیافته باشند
تمایلی به مهاجرت تصادفی به عنوان سلول های تک قطبی ندارند. تا زمانی که در تراکم پایین قرار دارند مهاجرت  می کنند تا این که در تماس با سلول دیگری قرار گیرند و مهاجرت متوقف گردد. سلول ها در تکه هایی ( patch ) تجمع می یابد و کل پچ ممکن است نشانه هایی از حرکت هماهنگ را نشان دهد.

-  تکثیر سلولی

چرخه سلولی از ۴ مرحله یا فاز ساخته شده است. در فاز M (میتوز) کروماتین به کروموزوم متراکم می شود و دو کروماتید منفرد که از کروموزوم ساخته شده اند هرکدام به یک سلول دختری جداگانه منتقل می گردند.  در فاز  G1 (Gap 1) سلول یا به سمت سنتز DNA و چرخه تقسیم دیگری پیشرفت می کند یا به صورت برگشت پذیر از چرخه سلولی (G0) خارج می شود یا یه صورت برگشت ناپذیر متعهد به تمایز می گردد. در طی G1 است که سلول اختصاصا مستعد کنترل پیشرفت چرخه سلولی در تعدادی از نقاط محدود کننده ( Restriction points) می باشد که تعیین می کند ایا سلول دوباره وارد چرخه شود ، از ان خارج شود یا خارج شود و تمایز پیدا کند. G1 با فاز S (DNA synthesis) دنبال می شود که DNA در ان همانندسازی انجام می دهد. S به نوبه خود بوسیله G2 (Gap 2) دنبال می شود که در ان سلول ها برای ورود دوباره به میتوز اماده می شوند. نقاط کنترلی ( Checkpoints ) در شروع سنتز DNA و در G2 بی نقص و سالم بودن DNA  را تعیین می کنند و چرخه سلولی را متوقف می کنند تا بهDNA   اجازه ترمیم بدهند یا اگر امکان ترمیم وجد نداشت وارد اپوپتوزیز شود. اپوپتوزیز یا مرگ برنامه ریزی شده سلول یک فرایند فیزیولوژیکی تنظیم شده  که بوسیله ان یک سلول می تواند از یک جمعیت حذف شود. بوسیله قطعه قطعه شدن DNA  ، متورم شدن هسته و انقباض سلول تشخیص داده می شود. اپوپتوز همچنین می تواند توسط تعدادی از آنزیم های نشانگر با کیت مثل Apotag (Oncor) یا COMET شناسایی شود.

- کنترل تکثیر سلولی

ورود به چرخه سلول بوسیله بوسیله سیگنال هایی از محیط تنظیم می شود. چگالی کم سلول سبب ایجاد سلول هایی با انتهای ازاد می گردد و به انها قدرت تکثیر می دهد که اجازه ورود انها را به داخل چرخه در حضور فاکتورهای رشد میتوژن میدهد مانند فاکتور رشد اپیدرمال (EGF) ، فاکتورهای رشد فیبروبلاست (FGFs) و یا فاکتورهای رشد مشتق شده از پلاکت ها (PDGF) که با گیرنده ای سطح سلول واکنش می دهند . چگالی بالای سلولی مانع تکثیر سلول های نرمال می شود. مهار رشد با تماس سلولی شروع شده و با ازدحام و تغییر حاصل در شکل سلول و کاهش گسترش رشد تکمیل می گردد. کنترل داخل سلولی توسط فاکتورهای اثرگذار مثبت مانند ساکلین ها میانجی گری می گردد که بوسیله آبشار انتقال سیگنال تنظیم می گردند که وقتی به فاکتور رشد متصل می شوند توسط فسفریلاسیون دومین (domain) داخل سلولی گیرنده فعال می شوند. عوامل منفی اثرگذار مانند p53 یا محصول ژن Rb پیشرفت چرخه سلولی را  در نقاط محدود کننده و checkpoint ها متوقف می کنند. ارتباط بین عناصر کنترل خارجی (هم مثبت مثل PDGF و هم منفی مثل TGF-β) ، عوامل موثر درون سلولی بوسیله گیرنده های غشاء سلول و مسیرهای انتقال سیگنال ساخته شده است که اغلب شامل فسفریلاسیون پروتئین و پیامبرهای ثانویه مانند cAMP ، Ca2+ و دی اسیل گلیسرول است.  بخش عمده ای از شواهد برای وجود این مراحل را در کنترل تکثیر سلولی از مطالعات انکوژن و بیان ژن سرکوبگر درسلولهای توموربا هدف نهایی تنظیم درمانی، تکثیر سلولی کنترل نشده در سرطان پدید آمده است. فایده فوری این مطالعات درک بهتری از عوامل مورد نیاز برای تنظیم تکثیر سلولی محیط کشت بوده است. این مطالعات فواید دیگری هم داشته است که شامل شناسایی ژن های افزایش دهنده تکثیر سلولی که برخی از انها می تواند برای نامیرا کردن لاین های سلولی استفاده شود.

- تمایز:  

بیان خصوصیات تمایزدر کشت های سلولی بوسیله پیشرفت تکثیر محدود می شود که برای تکثیر لاین سلولی و گسترش استوک ضروری می باشد. شرایط مورد نیاز برای القا تمایز مثل چگالی بالای سلول  افزایش اینتراکشن سلول – سلول و سلول- ماتریکس و وجود فاکتورهای مختلف تمایز ممکن اغلب با تکثیرسلولی انتاگونیسم داشته باشد و بالعکس. بنابراین اگر تمایز مورد نیاز می باشد ممکن لازم باشد که دو مجموعه شرایط مشخص تعریف شود یکی برای بهینه سازی تکثیر سلول  و یکی برای بهینه سازی تمایز سلولی.

- بقا تمایز

سالهاست مشخص شده که عملکردهای اختصاصی وقتی بیشتر حفظ می شوند که ساختارسه بعدی بافت همانند کشت اندام حفظ می شوند. بدبختانه کشت های اندام  نمی توانند تکثیر شوند.باید برای هر ازمایش به صورت de novo تهیه گردد و تعیین کمیت  انها سختتر از کشت های سلولی است. بازسازی ساختارهای سه بعدی بوسیله تزریق کشت های تک لایه و کشت دادن سلول ها داخل یا روی ماتریکس های خاص مانند ژل کلاژن ، سلولز یا اسفنج های ژلاتینی یا سایر ماتریکس ها ممکن گزینه بهتری باشد. یکی از بهترین محصولات تجاری Matrigel (BD Biosciences) است که خصوصیات ماتریکس خارج سلولی را بازسازی می کند ، اما تعریف نشده هستند ، اگرچه یک نسخه فاکتوررشد خالی (growth factor-depleted version) وجود دارد. در این تکنیک ها یکسری محدودیت هایی وجود دارد اما با ارائه  اینتراکشن های سلولی هموتایپیک و اینتراکشن های سلول ماتریکس و با امکان معرفی اینتراکشن های سلولی، زمینه بررسی عملکردهای اختصاصی بافت را فراهم می کنند. بیان فنوتیپ تمایز یافته ممکن نیاز به نگهداری در یک محیط مناسب انتخابی با القا کننده های مناسب داشته باشد مانند هیدروکورتیزون ، رتینوئیدها یا ترکیبات مسطح قطبی و معمولا در غیاب سرم. ایجاد عملکرد بافتی نرمال در محیط کشت بررسی رفتار پاتولوژیکی مانند دمیلینه شدن و حمله بدخیم را اسانتر میکند. به هرحال از یک نقطه نظر اساسی تنها وقتی سلول ها در شرایط in vitro عملکردهای طبیعی خود را بیان می کنند که هرگونه تلاشی برای مرتبط کردن انها با بافت مبدا صورت گیرد. بیان فنوتیپ تمایز نیاز به کامل شدن ندارد زیرا تظاهر یک نوع خاص انتی ژن سطحی برای قرار دادن یک سلول در دودمان (رده) صحیح کافی می باشد. بیان عملکردی کاملتر ممکن نیاز به قرار دادن یک سلول در موقعیت صحیح خود در رده وایجاد یک مدل صحیح از عملکرد خود در شرایط in vivo   داشته باشد. 

-  عدم تمایز

عدم توانایی لاین های سلولی در بیان خصوصیات فنوتیپی در شرایط  in vivo به علت عدم تمایز می باشد. بر اساس این مفهوم سلولهای تمایز یافته خصوصیات تخصصی خود را در شرایط  in vitroاز دست می دهند. اما هنوز مشخص نشده که ایا ۱) در شرایط  in vitro لاین های سلولی اشتباه انتخاب می شوند ۲) سلول های تمایز نیافته از همان دودمان بسیار بیشتر از سلول های تمایز یافته ای که ظرفیت تکثیرشان کاهش پیدا کرده رشد میکند یا ۳) عدم حضور القا کننده های مناسب (هورمون ها ، اینتراکشن ماتریکس یا سلول) سبب از دست دادن برگشت پذیرخصوصیات تمایز یافتگی میگردد. در عمل همه اینها ممکن است به از دست دادن تمایز منجر شود. حتی در شرایطی که دودمان صحیح انتخاب می شود ادامه تکثیر به نفع پیش سازهای تمایز نیافته است که در عدم حضور محیط القا کننده صحیح تمایز نمی یابند. باید بین عدم تمایز، عدم سازگاری و انتخاب (dedifferentiation - deadaptation selection-) تفاوت قائل شد. عدم تمایز بر این دلالت دارد که خصوصیات اختصاصی سلول ها بوسیله تبدیل به یک فنوتیپ ابتدایی تر از دست می رود. برای مثال یک هپاتوسیت خصوصیت انزیماتیک ( ارژینازو امینوترانسفراز) خودش را از دست خواهد داد و نمی تواند گلیکوژن را ذخیره کند یا پروتئین های سرمی را ترشح کند به دلیل اینکه دوباره به یک سلول پیش ساز تبدیل شده یا بازگشت کرده است. از سوی دیگر عدم سازگاری دلالت بر این دارد که سنتز محصولات اختصاصی یا سایر جنبه های عملکردهای اختصاصی تحت کنترل تنظیمی هورمون ها،  اینتراکشن سلول- سلول و اینتراکشن سلول - ماتریکس قرار دارند و در صورتی که شرایط مناسب دوباره ایجاد گردد می توانند دوباره القا شوند. برای مثال حضور یک ماتریکس به عنوان الوار کلاژنی شناور Matrigel یا دی متیل سولفوکسید (DMSO) اجازه حفظ خصوصیات تمایز را درهپاتوسیت ها می دهد. امروزه مشخص شده که با ایجاد شرایط مناسب در محیط کشت، عملکردهای تمایزی می توانند دوباره بیان شوند. برای ایجاد تحریک سلول های مناسب باید وجود داشته باشند. در تلاش های اولیه در محیط کشت سلول کبدی عدم موفقیت سلول ها برای بیان خصوصیات هپاتوسیتی به دلیل پوشیده شدن محیط کشت بوسیله فیبروبلاست بافت همبند یا سنسوئیدها بود. با استفاده از روش جداسازی صحیح و شرایط کشتی مناسب ترجیحا سلول های کبدی می توانند انتخاب شوند. به صورت مشابه سلول های اپیدرمال می توانند با استفاده از یا یک لایه تغذیه کننده همریز (feeder layer  confluent) یا یک کشت انتخابی رشد کنند. محیط کشت انتخابی برای انواع اپیتیلیوم استفاده شود. این و سایر مثال ها (مثل لایه های تغذیه کننده انتخابی، دی-والین برای جداسازی اپیتلیوم کلیه و استفاده از انتی بادی های سایتوتوکسیک ) به صورت واضح نشان میدهند که محیط کشت انتخابی سلول های تخصصی دست یافتنی است. بسیاری محیط های انتخابی عمدتا بر اساس مکمل Ham’s F12:DMEM یا سری های اصلاح شده MCDB طراحی شده اند و بسیاری اغلب به همراه محیط های کشت اختصاصی به صورت تجاری در دسترس هستند.

-  سیگنال دهی سلولی

تکثیر سلولی، مهاجرت، تمایز و اپوپتوزیز در داخل بدن به وسیله اینتراکشن سلول-سلول،  اینتراکشن سلول-ماتریکس،  سیگنال های هورمونی و تغذیه ای تنظیم می شوند. برخی سیگنالینگ ها با واسطه تماس از طریق مولکول های چسبندگی صورت میگیرند اما سیگنالینگ می تواند حاصل محلول وعوامل قابل انتشار باشد. سیگنالهایی که از سایر بافتها از طریق عروق سیستمیک (systemic vasculature) به سلول می رسد " اندوکرین " نامیده می شود و انهایی که از سلول های مجاور بدون ورود بدرون جریان خون انتشار پیدا میکنند "پاراکرین" نامیده می شوند. این برای نشان دادن اینکه برخی سیگنال های محلول بوجود می ایند و با سلولی از همان نوع وارد اینترکشن می شوند مفید می باشد. من این را سیگنال دهی homotypic paracrine یا homocrine می نامم. سیگنال هایی که در یک سلول متفاوت از سلول های پاسخ دهنده بوجود می ایند heterotypic paracrine یا paracrine هستند. یک سلول همچنین می تواند فاکتورهای سیگنال دهی خودش را تولید کند که به رسپتورهای خودش متصل می شوند و این سیگنال دهی autocrine نامیده می شود. اگرچه تمام شکل های سیگنالینگ در داخل بدن اتفاق می افتد تحت شرایط نرمال با محیط های کشت پایه در شرایط ازمایشگاه (درون شیشه ای) فقط سیگنال دهی اتوکرین و هموکرین رخ خواهد داد. عدم موفقیت بسیاری کشت ها برای عمل کردن با کارایی بالا در تراکم کم سلولی ممکن به علت غلظت یک یا چند فاکتور اتوکرین یا هموکرین باشد و این جزئی از استدلال استفاده از محیط های انتخابی یا لایه های تغذیه کننده برای افزایش کارایی کشت ها می باشد. اگر که بقا و تکثیر سلول های اختصاصی و القا تمایز انها بستگی به فاکتورهای پاراکرین و اندوکرین داشته باشد  باید این فاکتورها تشخیص داده شده و به محیط تمایز اضافه شود. به هرحال عملکرد انها ممکن کاملا پیچیده باشد به صورتی که دو یا چند فاکتور نیاز باشند تا به صورت سینرژی عمل کنند. اما در تلاش برای تحریک اینترکشن سلول – سلول بوسیله فراهم کردن فاکتورهای پاراکرین اگزوژنوس، لازم است  این موضوع را در نظر بگیریم که فنوتیپ سلول های دارای اینترکشن و بنابراین فاکتورهایی که انها تولید می کنند و چارچوب زمانی که در ان تولید می شوند به عنوان نتیجه اینتراکشن تغییر خواهند کرد. ترکیبات هتروتایپیک سلول ها ممکن در ابتدا ساده ترین راه فراهم کردن فاکتورهای صحیح در ماتریکس ریزمحیط (microenvironment) باشد وسپس انالیز این اینتراکشن ها ممکن با بلوکه کردن انتی بادی ها یا RNA انتی سنس امکان پذیر باشد.

- متابولیسم انرژی

بیشتر محیط های کشت حاوی ۲-۴ درصد گلوکز هستند که به عنوان منبع کربن گلیکولیز و تولید اسید لاکتیک به عنوان فراورده نهایی مورد استفاده قرار میگیرند. تحت شرایط نرمال کشت (اکسیژن اتمسفری و کشت غوطه ور) اکسیژن مدت کمی موجود است.در غیاب یک حامل مناسب مانند هموگلوبین افزایش فشار اکسیژن سبب تولید گونه های رادیکال ازاد می گردد که برای سلول سمی می باشند بنابراین اکسیژن معمولا در سطح اتمسفری فراهم می گردد.این در شرایط بی هوازی و استفاده از گلیکولیز برای متابولیسم انرژی حاصل می گردد. به هرحال چرخه سیتریک اسید فعال باقی می ماند و مشخص شده که اسیدهای امینه خصوصا گلوتامین می توانند به عنوان منبع کربن بوسیله اکسیداسیون ان به گلوتامات توسط گلوتاماز و ورود به چرخه اسید سیتریک بوسیله ترنس امیناسیون به ۲- اگزوگلوتارات استفاده شوند.دامیناسیون گلوتامین تمایل به تولید امونیا دارد که سمی می باشد و می تواند رشد سلول ا محدود کند اما استفاده از دی پپتیدها مثل گلوتامین- الانین یا گلوتامیل – گلیسین به نظر می رسد که تولید امونیا را کاهش می دهد و فایده دیگر ان پایداری بیشتر در محیط کشت است ( مثل   Glutamax, Invitrogen ).

- اغاز کشت

یک کشت یا از رشد سلول های مهاجرت کرده از یک قطعه بافت یا به وسیله پراکنده کرده انزیماتیک یا مکانیکی بافت مشتق شده است. صرفنظر از روش به کار گرفته شده، کشت اولیه در صدر مجموعه  فرایندهای انتخابی قرار دارد که ممکن نهایتا موجب ایجاد یک لاین سلولی نسبتا یک شکل شوند. انتخاب بوسیله ظرفیت بالقوه مهاجرت سلول ها از ریزنمونه رخ می دهد. در حالیکه با سلول های پراکنده تنها سلول هایی که هم در تکنیک های جداسازی و چسبیدن به سوبسترا یا در سوسپانسیون زنده مانده اند اساس کشت اولیه را تشکیل می دهند. اگر کشت اولیه برای بیشتر از چند ساعت دوام بیاورد مرحله انتخاب بعدی رخ می دهد. سلول هایی که توانایی تکثیر دارند افزایش پیدا می کنند، برخی انواع سلوا بقا پیدا می کنند اما تکثیر نمی کنند در حالیکه سایرین توانایی بقا را تحت شرایط خاص محیط کشت نخواهند داشت. بنابراین نسبت هر نوع سلول تغییر خواهد کرد و انجام این کار ادامه پیدا می کند تا (در مورد کشت های تک لایه (monolayer cultures) ) تمام سوبسترا مصرف شود. کشت های اولیه اگرچه برای برخی مطالعات مثل انالیزسایتوژنتیک مناسب باشد برای سایر مطالعات به دلیل ناپایدار بودن نامناسب می باشند. هم تغییرات جمعیت سلولی و هم تغییرات انطباقی در داخل سلول ها به طور پیوسته در محیط کشت رخ می دهد و تعیین یک دوره زمانی که کشت ممکن به صورت هموژنوس یا  پایدار در نظر گرفته شود را مشکل می کند. وقتی که تلاقی می رسد ( کلیه مناطق موجود برای رشد استفاده شده و سلول ها با یکدیگر تماس نزدیک پیدا می کنند) سلول هایی که رشدشان حساس به مهار تماسی و محدودیت تراکم تکثیر سلولی می باشد تقسیم را متوقف می کنند. در حالیکه هر سلول ترنسفورم شده ای (تغییر شکل یافته ای) که به محدودیت تراکم حساس نمی باشد تمایل به رشد زیاد دارد. پایین نگه داشتن تراکم سلول ( بوسیله subculture مکرر) به حفظ فنوتیپ طبیعی در کشت ها کمک می کند مانند فیبروبلاست موش که در آن ترانسفورم شده های خود به خودی تمایل به رشد زیاد در تراکم سلولی بالا دارند. برخی جنبه های عملکرد اختصاصی در کشت اولیه قوی تر بیان می شوند خصوصا وقتی که محیط کشت به تلاقی برسد. در این مرحله محیط کشت بیشترین شباهت مورفولوژیکی به بافت والدی نشان می دهد و در نوع سلول تنوع باقی می ماند.

- تکامل لاین های سلولی

بعد از اولین subculture یا پاساژ، کشت اولیه تحت عنوان cell line شناخته می شود و ممکن چندین بار تکثیر و کشت مجدد داده شوند. با هر subculture موفق بخشی از جمعیت با توانایی تکثیرسریعتر بتدریج غالب می شوند و سلول هایی که به کندی تکثیر می کنند یا تکثیر نمی کنند حذف می شوند. این بعد از اولین subculture کاملا واضح است که در ان ظرفیت تکثیر متفاوت با توانایی های مختلف برای مقاومت در برابر اسیب تریپسینازیسون و انتقال ترکیب شده است. اگرچه برخی انتخاب ها و دریفت های (رانش) فنوتیپی ادامه پیدا خواهد کرد در پاساژ سوم کشت پایداری بیشتری پیدا می کند و با سلول هایی که دارای سرعت تکثیر بیشتر و مقاوم ترهستند مشخص می گردد. بدون وجود سرم و انتخاب شرایط خاص سلول های مزانشیمی مشتق از فیبروبلاست های بافت همبند یا عناصر عروقی مکررا در کشت رشد می کنند. اگرچه این امر منجر به برخی رده های سلولی بسیار مفید می شود ( مثل WI-38 فیبروبلاست جنینی ریه انسان،  BHK21 فیبروبلاست کلیه نوزاد همستر،  سلول های COS،  سلول های CHO و شاید معروف تر از همه L-cell فیبروبلاست زیرجلدی موش تیمار شده با  ( methylcholanthreneاین رشد بیش از حد نشان دهنده یکی از چالش های عمده کشت بافت از زمانی که کار خود را اغاز کرده است یعنی چگونه از رشد بیش از حد سلول های تخصصی کند رشد و شکننده تر مانند پارانشیم کبدی یا کراتینوسیت اپیدرمال جلوگیری کنند.نامناسب بودن شرایط کشت، تا حد زیادی به این مشکل مربوط می شود و پیشرف تهای قابل توجهی درحال حاضردراستفاده از محیط کشت ها و بسترهای انتخابی برای بقا و نگهداری بسیاری از لاین های سلولی تخصصی  صورت گرفته است.

-  پیری

سلول های نرمال تنها تعداد دفعات محدودی می توانند تقسیم شوند بنابراین لاین های سلولی مشتق شده از بافت نرمال پس از اینکه جمعیت به تعداد ثابتی چند برابر شد میمیرند. این به لحاظ ژنتیکی یک  پدیده معین است که شامل چندین ژن مختلف و تحت عنوان پیری شناخته می شود. تصور بر این است که ان بوسیله عدم توانایی همانندسازی سکانس های انتهایی DNA در تلومرها درهر تقسیم سلولی صوت میگیرد. نتیجه ان کوتاه تر شدن تدریجی تلومرهاست تا انجایی که نهایتا سلول قادر به تقسیم بیشتر نیست. استثنا این قاعده سلول های زایا،  سلول های بنیادی و سلول های ترنسفورم شده می باشد که اغلب انزیم تلومراز را بیان می کنند که توانایی همانندسازی سکانس های انتهایی DNA را در تلومر دارند و طول عمر سلول ها را افزایش می دهند یا در مورد سلول های زایا و برخی سلول های توموری انها را نامیرا می کنند.

-  ایجاد لاین های سلولی پیوسته

بعضی لاین های سلولی ممکن  لاین های سلولی پیوسته را بوجود اورند. توانایی یک لاین سلولی برای رشد به صورت پیوسته ممکن نشان دهنده ظرفیت ان برای تنوع ژنتیکی باشد که اجازه انتخاب سکانس را می دهد. تنوع ژنتیکی اغلب شامل حذف یا جهش ژن p53 می باشد که اغلب مانع پیشرفت چرخه سلولی می گردد اگر DNA دچار جهش شود یا ژن تلومراز بیش از حد بیان شود. فیبروبلاست های انسان عمدتا در تمام طول عمر خود در کشت یوپلوئید باقی می مانند و هرگز لاین های سلولی پیوسته را بوجود نمی اورند در حالیکه فیبروبلاست های موش و کشت های سلولی از انواع تومورهای انسان و حیوان در کشت انوپلوئید می شوند و تبدیل به کشت های پیوسته می شوند. احتمالا شرط اصلی برای مستعد شدن به ایجاد لاین های سلولی پیوسته تنوع ژنتیکی ذاتی (ارثی) است. بنابراین یافتن ناپایداری ژنتیکی مستمر در لاین های سلولی پیوسته تعجب برانگیز نیست. یکی از ویژگی های مشترک لاین های سلولی پیوسته ایجاد یک عدد کروموزوم ساب تتراپلوئید (subtetraploid) است. تغییر در یک محیط کشت که سبب ایجاد یک لاین سلولی پیوسته میشود معمولا transformation in vitro نامیده می شود و ممکن به صورت خود به خود یا به صورت شیمیایی یا ویروسی القا شود. کلمه  transformation به صورت نسبی استفاده می شود و میتواند برای افراد متفاوت معنای متفاوتی داشته باشد. در اینجا نامیرا شدن (immortalization) به معنی دستیابی به طول عمر نامحدود و transformation نشان دهنده یک تغییر اضافی در خصوصیات رشدی (استقلال لنگراندازی ،از دست دادن مهار تماسی و محدودیت تراکم رشد) است که اغلب اما نه لزوما با تومورزایی (tumorigenicity) مرتبط می باشد. لاین های سلولی پیوسته معمولا انوپلوئید هستند و اغلب دارای تعداد کروموزوم بین دیپلوئید و تتراپلوئید دارند. همچنین تغییرات قابل توجهی در تعداد و ساختمان کروموزوم در بین سلول های جمعیت وجود دارد  (heteroploidy). مشخص نیست که ایا سلول هایی که منجر به ایجاد لاین های سلولی پیوسته می شوند درنمونه به تعداد کم وجود دارند یا بعدا به عنوان نتیجه ترسفورمیشین یک یا چند سلول بوجود می ایند. دومین پیشنهاد درزمینه های کینیتیک سلولی است که محتمل تر به نظر می رسد. از انجایی که لاین های سلولی پیوسته می توانند کاملا دیر در زندگی یک کشت ظاهر شوند، مدتها پس از ان زمان حتی اگرتنها یک سلول  برای رشد وجود داشته باشد ممکن اتفاق بیفتد. به هرحال این احتمال باقی می ماند که در چنین کشت هایی زیر جمعیتی وجود دارد که دارای استعداد ترنسفورم شدن می باشد و با سایر سلولها به اشتراک گذاشته نمی شود. واژه ترنسفورمیشن برای فرایند تشکیل یک لاین سلولی پیوسته به کار می رود تا حدودی به دلیل اینکه کشت دستخوش تغییرات مورفولوژیکی و کینتیکی گردد و همچنین به این دلیل که تشکیل یک لاین سلولی پیوسته همراه با افزایش تومورزایی است. تعدادی از خصوصیات لاین های سلولی پیوسته مثل کاهش سرم مورد نیاز،  کاهش محدودیت تراکمی رشد،  رشد در محیط های نیمه جامد و انوپلوئیدی در ارتباط با ترنسفورمیشین بدخیم است.  تغییرات رفتاری و مورفولوژیکی مشابهی می تواند در سلول های که دستخوش ترنسفورمیشن القا شده به صورت شیمیایی یا ویروسی می شوند مشاهده شود. بسیاری از سلول های طبیعی منجر به ایجاد لاین های سلولی پیوسته نمی شوند. در مثال کلاسیک فیبروبلاست های انسانی نرمال درتمام طول عمر خود یوپلوئیدی باقی می مانند و در بحران (معمولا حدود ۵۰ نسل) تقسیم متوقف می شود اگرچه ممکن انها ۱۸ ماه بعد از ان هم زنده بمانند. گلیا انسان و فیبروبلاست های جوجه رفتار مشابهی دارند. از طرف دیگر سلول های اپیدرمال افزایش طول عمر با پیشرفت تکنیک های کشت نشان داده اند و ممکن در عین حال توانایی ایجاد لاین های سلولی پیوسته را نشان دهند. چنین رشدی ممکن مربوط به ظرفیت خود تجدیدکنندگی self-renewal)) بافت در شرایط  in vivo و تکثیر موفق سلول های بنیادی در شرایط  in vitro می باشد. کشت پیوسته سلول های لیمفوبلاستوئید هم به وسیله ترنسفورمیشن با ویروس اپشتین-بار امکان پذیر می باشد.

- منشا سلول های کشت

به دلیل اینکه بسیاری از افراد تحت شرایط استاندارد با لاین های سلولی تکثیر شونده پیوسته یا نامیرا کار می کنند مهم است که ترکیب سلولی محیط کشت را در نظر بگیرند. ظرفیت بیان مارکرهای تمایزیافته تحت تاثیر شرایط القایی ممکن یا به این معنا باشد که سلول هایی که کشت می شوند بالغ هستند و تنها نیاز به القا دارند تا به سنتز پروتئین های اختصاصی ادامه دهند یا اینکه کشت از پیش سازها یا سلول های بنیادی تشکیل شده که توانایی تکثیر دارند اما به صورت تمایز نیافته باقی می مانند تا زمانیکه شرایط مناسب القا بکار رود که به دنبال ان تمام سلول ها بالغ شده و تمایز می یابند. ممکن مفید باشه که فکر کنیم در محیط کشت سلولی بین سلول های بنیادی چندظرفیتی ( multipotent stem cells) ، سلول های پیش ساز متعهد اما تمایز نیافته و سلول های تمایز یافته بالغ تعادل وجود دارد و فرض کنیم که تعدل با توجه به شرایط محیطی تغییرمی کند. پاساژهای سریالی روتین در تراکم سلولی نسبتا کم تکثیر سلولی را تقویت و تمایز را محدود می کنند در حالیکه در تراکم سلولی بالا ، سرم کم و هورمون های مناسب تمایز تقویت و تکثیر سلولی مهار می شود. منبع محیط کشت همچنین تعیین کننده این است که چه ترکیبات سلولی ممکن وجود داشته باشند. بنابراین لاین های سلولی مشتق از جنین ممکن حاوی سلول های بنیادی و پیش ساز بیشتری باشند و دارای قابلیت خود تجدیدکنندگی بیشتری نسبت به کشت بالغین باشند. به علاوه کشت های بافتی (اپیدرمیس، اپیتلیوم روده ای ، سلول های خون ساز) که در شرایط in vivo تحت تجدید مداوم قرار دارند ممکن هنوز حاوی سلول های بنیادی باشند که تحت شرایط مناسب یک زندگی طولانی مدت را خواهند داشت در حالیکه کشت های بافتی (فیبروبلاست ها، گلیا ،ماهیچه)  که تنها در شرایط استرس تجدید می شوند ممکن تنها حاوی سلول های پیش ساز متعهد با طول عمر محدود باشند. بنابراین شناخت سلول های کشت شده نه تنها بوسیله دودمان  انها (خونساز، کبدی، گلیال) در شرایط in vivo بلکه همچنین  توسط  موقعیتش (سلول های بنیادی، سلول های پیش سازیا سلول بالغ تمایز یافته) در ان دودمان تعریف می شود. اگرچه به نظر می رسد که پیشرفت در مسیر تمایز غیر قابل بازگشت باشد مفهوم تعهد در حال حاضر مورد تردید است و برخی از سلول های پیش ساز ممکن قادر به تبدیل یا بازگشت به حالت سلول بنیادی باشند و در همان دودمان یا یک دودمان متفاوت دوباره تمایز پیدا کنند. وقتی سلول های یک تومور را کشت می دهیم انها نیازی به پیروی از این قوانین ندارند. بنابراین تومور کبد موش ممکن در شرایط in vitro تکثیر کند و هنوز هم برخی ویژگی های تمایزیافتگی را بیان کند اما هرچه بیشتر به فنوتیپ نرمال نزدیک می شوند القای تمایز بیشتر ممکن مانع تکثیر شود. اگرچه ممکن ارتباط بین موقعیت در دودمان و تکثیر سلولی اسان باشد ( باوجود از دست ندادن B16 سلول های ملانوم هنوز رنگدانه های بیشتری را در تراکم سلولی بالا و سرعت تکثیر پایین  نسبت به تراکم پایین سلولی و سرعت بالای تکثیر سلولی تولید می کنند) اما انتقال بین دودمان ها به خوبی اثبات نشده است.