microbiology

ژنوم Ecoli حاوی بیش از 3000 ژن است.تعدادی از این ژنها همیشه فعال میباشند زیرا برای ادامه رشد باکتری همواره مورد نیاز میباشند.اما تعدادی از آنها اغلب اوقات خاموش میباشند زیرا محصول آنها به ندرت مورد نیاز است.

برای مثال آنزیمهای مورد نیاز برای متابولیسم قند آرابینوز تنها زمانی مورد نیاز میباشد که محیط کشت واجد این قند و فاقد قند ساده ی گلوکز باشد.

فرایند بیان ژن فرایند گران و انرژی خواهی است.انرژی زیادی مورد نیاز است تا RNA یک ژن تولید و از آن پروتئین ساخته شود.

سیستمهای کنترل رونویسی و تنظیم بیان ژنها:

اپرون لک:

این اپرون آنزیمهایی را که سلول Ecoli را قادر به استفاده از لاکتوز میکند تولید کرده و حاوی 3 ژن است.فرض کنیم باکتری Ecoli در یک فلاسک حاوی گلوکز و لاکتوز در حال رشد باشد رشد سلولها پس از استفاده کامل از گلوکز متوقف میشود و وارد یک فاز lag میشود در این فاز ژنهای اپرون لک که برای متابولیسم لاکتوز مورد نیاز است بیان میشود.

این اپرون دارای 3 ژن میباشد:

1.گالاکتوزید پرمئاز(برای انتقال لاکتوز به درون سلول)

 2.بتا گالاکتوزیداز(که لاکتوز را به گلوکز و گالاکتوز تبدیل میکند)

3.گالاکتوزید ترنس استیلاز(عملکرد آن در متابولیسم لاکتوز هنوز شناخته شده نیست)

این 3 ژن با ترتیب بتا گالاکتوزیدازlacZ.گالاکتوزید پرمئازlacY.گالاکتوزید ترنس استیلازlacA در اپرون قرار میگیرند.

این 3 ژن بصورت یک RNA پلی سیسترونی رونویسی میشوند.با اینکه رونویسی این سه ژن تحت تنظیم یک پروموتر است اما هر کدام جایگاه اتصال ریبوزوم خاص خود را دارند و بصورت مستقل ترجمه میشوند.

 کنترل منفی اپرون لک:

ژن کنترل منفی به این مفهوم است که اپرون بدون مداخله فاکتوری که سبب توقف بیان آن شود روشن میباشد.به فاکتوری که سبب خاموش شدن اپرون میشود مهار کننده لک(repressor)میگویند.محصول ژن lac I بوده که دارای 4 زیر واحد یکسان است که به اپراتور پایین دست پروموتر متصل میشود.زمانی که مهار کننده به اپراتور متصل شود اپرون مهار میشود.این مهار بدلیل این است که با نشستن مهار کننده روی اپراتور از اتصال RNA pol به پروموتر جلوگیری میشود.

در صورتیکه گلوکز در محیط وجود نداشته باشد و لاکتوز در محیط باشد مهار کننده باید برداشته شود تا از منبع غذایی جدید استفاده شود.در واقع مهار کننده یک پروتئین آلوستریک است به این مفهوم که اتصال یک ملکول به پروتئین سبب تغییر ساختار فضایی ملکول و بنابراین تغییر میانکنش آن با ملکول دیگری میشود.به چنین ملکولی تحریک کننده(inducer)اپرون لک گفته میشود.inducer با اتصال به repressor با ایجاد تغییر ساختمان فضایی آن سبب جدایی آن از operator میشود.

Inducer اپرون لک در واقع آلولاکتوز(آنالوگ لاکتوز)است.آنزیم بتا گالاکتوزیداز ضمن شکست لاکتوز به گلوکز و گالاکتوز قسمت کمی از آنرا به آلولاکتوز تبدیل میکند که تنها تفاوت آن با لاکتوز این است که پیوند بین گلوکز و گالاکتوز B1à6 است.مهار این اپرون دارای نشت است و مقداری رونویسی پایه انجام میشود.این مقدار کم رونویسی امکانی است تا در صورت وجود لاکتوز مقدار کافی آلولاکتوز بسازد زیرا در هر سلول تنها 10 مهار کننده حضور دارد.

کنترل مثبت اپرون لک:

کنترل مثبت معکوس کنترل منفی میباشد که در این نوع کنترل اپرون بدون دخالت فاکتوری که سبب روشن شدن اپرون شود خاموش باقی میماند.در خصوص اپرون لک تنها برداشته شدن مهار کننده از روی اپراتور سبب مقدار کافی رونویسی نمیشود بلکه به کنترل مثبت برای افزایش بیان نیز مورد نیاز است.این سیستم باعث میشود زمانیکه هنوز گلوکز در محیط کشت وجود دارد اپرون لک خاموش باشد.اگر سیستمی برای پاسخ به سطح گلوکز در محیط کشت وجود نداشته باشد حضور لاکتوز به تنهایی برای فعال کردن اپرون کافی است.با توجه به اینکه متابولیسم گلوکز برای Ecoli  ساده تر از لاکتوز است این فعالیت اپرون مطلوب نمیباشد.به این نحوه مهار اپرون لک مهار کاتابولیک گفته میشود.

بنابراین کنترل مثبت اپرون لک باید فاکتوری باشد که فقدان گلوکز را حس کند و سبب بیان اپرون لک شود.فاکتوری که به غلظت گلوکز پاسخ میدهد CAMP است.زمانیکه غلظت گلوکز کاهش می یابد غلظت CAMP افزایش می یابد.CAMP با اتصال به یک فاکتور پروتئینی بنام CAP سبب تحریک رونویسی میشود.در واقع جایگاه اتصال CAP در بالادست پروموتر سبب افزایش پایداری اتصال RNA pol و افزایش میزان رونویسی میشود.

رگولون Mal:

گروهی از ژنها که مجموعه ای از آنزیمها را برای متابولیسم مالتوز کد میکنند.ژنهای کد کننده این آنزیمها در یک اپرون قرار نمیگیرند بلکه هر یک تحت تنظیم پروموتر خود میباشند اما کنترل بیان آنها هماهنگ صورت میگیرد.به چنین مجموعه ای رگولون گفته میشود.

در تنظیم این رگولون با توجه به اینکه مالتوز منبع اصلی انرژی نیست CAP نقش ایفا میکند.پروتئین دیگری نیز بنام MalTدر تنظیم پروموترهای Mal دخالت دارد.این پروتئین به ATP و مالتوتریوز بعنوان محرک inducer رگولون برای فعالیت خود نیاز دارد.بعضی از پروموترهای این رگولون هم به CAP و هم به MalT نیازمند میباشند.

اپرون trp:

این اپرون حاوی ژنهای آنزیمهایی است که در سنتز اسید آمینه trp دخالت دارند.بنابر این بر خلاف اپرون لک که آنزیمهای کاتابولیک را کد میکند این اپرون آنزیمهای آنابولیک را کد میکند.در صورتی که مقدار کافی trp وجود داشته باشداین اپرون خاموش میشود.این اپرون 5 آنزیم را کد میکند تا chorismic acid به tryptophan تبدیل شود.اپراتور این اپرون روی پروموتر قرار گرفته است.در عدم حضور trp فرم غیر فعال مهار کننده به نام aporepressor وجود دارد که به operator متصل نمیشود و رونویسی انجام میشود.در حالیکه در حضور trp و اتصال آن بر مهار کننده سبب فعال شدن آن و اتصالش به اپراتور میشود که مانع از انجام رونویسی میشود.علاوه بر کنترل منفی این اپرون مکانیسم دیگری برای کنترل این اپرون وجود دارد بنام attenuation یا تخفیف حدت.دلیل وجود این مکانیسم ضعف سیستم تنظیمی کنترل منفی میباشد.

کنترل اپرون trp با استفاده از attenuation:

اپرون trp دارای دو قسمت از trp leader وtrp attenuator است که بین اپراتور و اولین ژن قرار میگیرد.در هنگامیکه تریپتوفان به مقدار کافی وجود داشته باشد trp attenuator سبب خاتمه رونویسی بصورت زود هنگام و ایجاد رونوشت ناقص میشود و بنابراین رونویسی کامل انجام نخواهد شد.

Trp attenuator دارای یک سیگنال خاتمه رونویسی است که ایجاد یک ساختار ساقه حباب میکند.اگر بین ناحیه 1و2 – 3و4 ساختار ساقه حباب ایجاد شود(تنها در حضور trp)سیگنال خاتمه داده میشود در حالیکه اگر بین ناحیه 2و3 ساختار ساقه حباب ایجاد شود این ساختار ناپایدار است و بنابراین رونویسی انجام میشود(در عدم حضورtrp)

علت تشکیل و عدم تشکیل این ساختارهای ساقه حباب ریبوزوم است همانطور که میدانیم بلافاصله بعد از شروع رونویسی ترجمه آغاز میشود و در قسمت اول ژن تکراری از کدون اسیدآمینه trp میباشد.اگر trp وجود نداشته باشد ریبوزوم بدلیل عدم وجود اسیدآمینه این کدونها روی trp leader متوقف میشود و باقی ماندن ریبوزوم در این ناحیه اجازه تشکیل ساقه حباب 2و1 – 3و4 را نمیدهد و رونویسی انجام میشود.اگر trp وجود داشته باشد ریبوزوم مکث نمیکند و اجازه تشکیل ساقه حباب پایدار را میدهد و ساقه حباب تشکیل میشود و رونویسی قبل از کامل شدن خاتمه می یابد.

رونویسی در پروکاریوتها:

اولین مرحله در بیان ژن رونویسی یا Transcription است.در واقع رونویسی محل اصلی کنترل بیان بسیاری از ژنهاست.در باکتری Ecoli بعنوان یک ارگانیسم پروکاریوتی تیپیک رونویسی توسط یک آنزیم RNA polymerase انجام میشود.ابتدا در خصوص زیر واحدها و ساختار این آنزیم صحبت کرده و سپس مراحل رونویسی را شرح میدهیم.

ساختمان RNA pol:

این آنزیم با مطالعات SDS-PAGE که انجام گرفته دارای زیر واحدهای زیر است:

α β β’ ω σ

به ترتیب با وزنهای ملکولی 40.150.160.70 کیلو دالتون میباشند.

به دو صورت دیده میشود:

1.holoenzyme که تمام زیر واحدها را دارد.

2.core enzyme که فاقد زیر واحد σ است.

بنابراین تفاوت اصلی core enzyme  و holoenzyme  در وجود یا عدم وجود فاکتور سیگما است و مطالعه تفاوت بین این دو ساختار آنزیمی نقش فاکتور σ را بیان میکند.با انجام مطالعات مشخص شده است که core اختصاصی عمل نمیکند به این مفهوم که کلاسهای ژنی را تشخیص نمیدهد.هم چنین قادر به تشخیص رشته الگو از غیر الگو نمیباشد و توانایی رونویسی از DNA دست نخورده و سالم را نیز دارا نمیباشد.همه ی این تفاوتها نشان میدهد فاکتور σ در اختصاصی عمل کردن آنزیم نقش دارد بهمین دلیل نام آنرا σ گذاشته اند که معادل S انگلیسی از Specificity یا اختصاصیت میباشد.

فاکتور σ در باکتری به دو گروه اصلی تقسیم میشود:

1.σ اولیه در باکتری Ecoli حدود 70KD و در B.subtilis حدود43KDمیباشد و مسئول رونویسی از ژنهای خانه دارhouse keeping genes  میباشد.

2.σ ثانویه که در مراحل خاصی از فاز رشد باکتری بیان میشود.بعنوان مثال در اسپورسازی باسیلوسها و...فاکتورσ از لحاظ ساختمانی دارای چهار ناحیه مشابه است که تقریبا در تمام سیگما فاکتورهای باکتریها دیده میشود.

ناحیه1:ممانعت از اتصال σ فاکتور به تنهایی به پروموتر که در صورت اتصال رونویسی مهار میشود.

ناحیه2:دارای دو زیر ناحیه اصلی 2.1 با نقش اتصال به RNA pol و 2.4 شناسایی و اتصال به TATA box است.

ناحیه3:دارای موتیف HTH و احتمال در اتصال به DNA نقش دارد.

ناحیه4:دارای چندین زیر ناحیه که 4.2 در اتصال و شناسایی جعبه 35- پروموتر نقش ایفا میکند.

نقش زیر واحدα:

با وزن ملکولی 40KD که دارای دو دومین αCTD & αNTD است.نقش اصلی این زیر واحد کمک به اجتماع و اسمبلی سایر زیر واحدها بوده و نقش مرکزی را ایفا میکند.

با این حال αCTD در شناسایی اجزا بالادست پروموترup element و افزایش پایداری آنزیم RNA pol  روی پروموتر و بنابراین افزایش توان پروموتر نقش ایفا میکند.

زیر واحد β و β’:

در کنار یکدیگر جایگاه فعال آنزیم را ایجاد میکند که محل تشکیل پیوندهای فسفودی استری است.مرکز کاتالیتیک آنزیم روی زیر واحد β’ با توالی NADFDGD است که سه آسپارتیک اسید در هماهنگی محل قرارگیری Mg++ نقش حیاتی دارند و هر گونه موتاسیون در آن سبب مرگ سلول میگردد.

زیر واحد ω:

به انتهای کربوکسیلی β’ متصل شده و در پیچش و شکل فضایی این زیر واحد موثر است.

ساختار پروموتر در پروکاریوتها:

پروموتر در پروکاریوتها دارای دو جز اصلی است:

1.اجزای اصلی پروموتر core promoter(آنزیم RNA pol آنها را بدون واسطه شناسایی میکند)

2.اجزای بالادست up stream elements (برای شناسایی آنها نیاز به پروتئین های دیگر میباشد)

اجزای اصلی پروموتر شامل:

1.TATA box در موقعیت10-

2.-35 box

3.فاصله بین دو جعبه 10- و 35- با طول 1-/+17

4.up elements در 40- تا 60- که توسط زیر واحد α شناسایی میشود

اجزای بالادست شامل Fis site در موقعیت 60- تا 150- که توسط پروتئین fis شناسایی و سبب افزایش توان پروموتری میشوند.

مراحل رونویسی در پروکاریوتها:

دارای 3 مرحله اصلی است:آغازinitiation .ادامهalongation .خاتمهtermination

مرحله آغاز:

این مرحله خود به 4 زیر مرحله اصلی تقسیم میشود:

1.تشکیل کمپلکس پروموتری بستهCPC  که عبارتست از اتصال ضعیف RNA pol به DNA که ممکن است روی پروموتر باشد یا نباشد.

2.تبدیل CPC به کمپلکس پروموتری باز OPCکه در آن اتصال محکم RNA pol با پروموتر رخ میدهد و DNA ذوب میشود.

3.پلی مریزه کردن اولین نوکلئوتیدها در حالیکه RNA pol روی پروموتر باقی میماند و رونوشت های سقط شده تولید میکند.در این مرحله طول هیبرید DNA & RNA زیر 10b است.

4.ترخیص پروموتر زمانیکه طول هیبرید RNA-DNA در حباب رونویسی به بیش از 10b میرسد و ساختمان پایداری ایجاد میشود.RNA pol پروموتر را ترک میکند.

مرحله ادامه:     

در این مرحله پلیمریزاسیون بازها ادامه می یابد اما توپولوژی حرکت آنزیم مورد بحث است که مشخص شده آنزیم دور DNA نمیچرخد زیرا این امر سبب چرخش رونوشت به دور DNA میشود و آنزیمهای خاص برای باز کردن آن وجود ندارد.بلکه آنزیم بصورت انقباض و انبساط روی DNA میخزد.

 مرحله خاتمه:

خاتمه رونویسی در پروکاریوتها به دو صورت انجام میگیرد:

1.وابسته به فاکتور ρ

2.مستقل از فاکتور ρ

در خاتمه رونویسی مستقل از فاکتور ρ تمام اطلاعات مورد نیاز روی خود RNA است و شامل:

1.توالی های تکرار معکوس که سبب ایجاد ساختار سنجاق سر یا ساقه حباب میشوند.

2.توالی غنی از T روی رشته غیر الگو یا غنی از U  روی رونوشت.

در این نوع خاتمه پس از تشکیل ساختار ساقه حباب آنزیم RNA pol قادر به پیشروی نبوده و مکث میکند در حالیکه رونوشت از طریق پیوندهای ضعیف rU-dA به DNA متصل است بنابراین رونوشت به آسانی از DNA جدا میشود و رونویسی خاتمه می یابد.

در خاتمه وابسته به فاکتور ρ یک فاکتور پروتئینی هگزامری از زیر واحدهای کاملا یکسان به نام ρ دخالت دارد.اطلاعات روی رونوشت شامل:

1.جایگاه بارگذاری ρ(ρ loading site) توالی بیش از 100bغنی از C که ρ به آن متصل میشود و آنزیم RNA pol را تعقیب میکند.

2.توالی تکرار معکوس که سبب ایجاد ساختار ساقه حباب و مکث آنزیم میشود.

پس از رسیدن به جایگاه خاتمه با رونویسی توالی تکراری معکوس آنزیم مکث میکند و فاکتورρ با هیدرولیز ATP و خاصیت هلیکازی خود رونوشت را از دل آنزیم خارج کرده و رونویسی را خاتمه میبخشد.